Trang: 37

Tập 31, số 3 2021

OPTIMIZATION AND APPLICATIONS OF NESTED – POLYMERASE CHAIN REACTION FOR RAPID DETECTION OF HISTOPLASMA CAPSULATUM BASED ON HPC100 GENE

Tác giả: Đỗ Ngọc Ánh, Nguyễn Khắc Lực, Nguyễn Thị Như Quỳnh, Tạ Bá Thắng, Nguyễn Thanh Tùng, Lương Minh Hòa, Đỗ Bích Ngọc, Phạm Thanh Hải, Minoru Nagi, Miyazaki Yoshitsugu, Hoàng Thị Thu Hà

Tóm tắt:
Nghiên cứu nhằm mục tiêu thiết lập các điều kiện của kỹ thuật nested PCR để phát hiện nhiễm nấm Histoplasma capsulatum dựa vào gen đích Hcp100. Kỹ thuật sau khi xây dựng được thử nghiệm đánh giá trên ADN tổng số tách chiết từ các mẫu dịch rửa phế quản của bệnh nhân có hội chứng viêm đường hô hấp dưới. Kết quả nghiên cứu cho thấy, kỹ thuật nested PCR với phản ứng PCR1 (cặp mồi HcI, HcII) cho kết quả tốt khi nồng độ Mg2+ là 2,0mM, nhiệt độ gắn mồi 50oC; phản ứng PCR2 cho kết quả tốt khi nồng độ Mg2+ là 1,5mM, nhiệt độ gắn mồi 65oC. Giới hạn phát hiện của kỹ thuật là 10fg ADN plasmid của nấm H. capsulatum. Các mồi sử dụng cho kỹ thuật nested-PCR có tính đặc hiệu cao với nấm H. capsulatum. Để đánh giá hiệu quả của kỹ thuật nested PCR đã xây dựng, 96 mẫu ADN tách chiết từ dịch rửa phế quản của bệnh nhân có hội chứng viêm đường hô hấp dưới đã được kiểm tra và đều cho kết quả ấm tính. Nuôi cấy cũng cho kết quả tương tự. Đây là kỹ thuật cho kết quả nhanh, tin cậy và có thể lựa chọn để phát hiện nhiễm nấm H. capsulatum.

Summary:
This study aims to optimize and apply nested – polymerase chain reaction for rapid detection of Histoplasma capsulatum based on hpc100 gene. A nested PCR was developed to detect Histoplasma capsulatum in two reactions based on Hcp100 gene of H. capsulatum. The results showed that the nested –PCR method with HcI, HcII primers (PCR1) and HcIII, HcIV (PCR2) allows simple, rapid and reliable detection to identify H. capsulatum with 2,0mM Mg2+ and annealing temperature 50oC for the frst round and 1,5mM Mg2+ and 65oC for the second round PCR. The minimum PCR detection limit was 10fg of H. capsulatum plasmid DNA. In order to evaluate the developed nested PCR, 96 DNA samples of bronchoalveolar lavage fluid were examined for detection of H. capsulatum infections. H. capsulatum infection did not reveal in bronchoalveolar lavage fluid. This result were similar to those of culture on Sabouraud dextrose agar. This assay provides a rapid and reliable solution compared to conventional methods to diagnose H. capsulatum

Từ khóa:
PCR lồng; phát hiện; gen Hpc; Histoplasma capsulatum

Keywords:
Nested PCR; detection; Hpc100; H. capsulatum

DOI: https://doi.org/10.51403/0868-2836/2021/312

File nội dung:
o210337.pdf

Tải file:

Tải file với tiền ảo trong tài khoản thành viên.