Trang: 75
Tập 27, số 2 (190) 2017
Xây dựng quy trình kỹ thuật khuếch đại gen lồng đa mồi phát hiện hai nấm Cryptococcus neoformans và Candida albicans
Development of a nested – multiplex polymerase chain reaction applied for rapid detection and identification of Cryptoccus neoformans and Candida albicans
Tác giả: Đỗ Ngọc Ánh, Nguyễn Duy Bắc, Nguyễn Trọng Chính
Tóm tắt:
Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) đa mồi (multiplex PCR) kết hợp PCR lồng (nested PCR) được phát triển để phát hiện đồng thời nấm Cryptococcus neoformans và Candida albicans trong hai phản ứng khuếch đại gen. Hai cặp mồi đặc biệt được thiết kế dựa vào đích là vùng gen acid ribonucleic (ARN) ribosome của 2 nấm nói trên. Kỹ thuật sau khi xây dựng được thử đánh giá trong phòng thí nghiệm trên các mẫu acid deoxyribonucleic (ADN) của nấm Cryptococcus neoformans và Candida albicans. Kết quả nghiên cứu cho thấy, kỹ thuật nested – multiplex PCR với phản ứng PCR 1 (cặp mồi ITS1, ITS4) cho kết quả tốt khi nhiệt độ gắn mồi là 55oC; phản ứng PCR 2 cho kết quả tốt khi có các điều kiện nồng độ Mg2+ 2,0mM, dNTPs 300μM, nồng độ mồi 0,2-0,3pmol/μl và nhiệt độ gắn mồi là 57oC. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật trên cả 2 nấm là 100%, giới hạn phát hiện của kỹ thuật là 1pg mỗi nấm trong hỗn dịch phản ứng PCR. Đây là kỹ thuật cho kết quả nhanh, tin cậy và có thể lựa chọn để xác định Cryptococcus neoformans và Candida albicans.
Summary:
A nested – multiplex Polymerase Chain
Reaction (PCR) method was developed to identify
simultaneously Cryptococcus neoformans ( C.
neoformans) and Candida albicans (C. albicans)
in two reactions. Two sets of species-specific
primers were designed from the internal
transcribed spacer (ITS) regions of targets on
the ribosome ribonucleic acid (rRNA) genes
of C. albicans and C. neoformans. The results
showed that nested – multiplex PCR method
with ITS1, ITS4 primers (PCR 1) and CrN4,
CrN5, CalB1, CalB2 (PCR 2) allows simple,
rapid and reliable detection to identify C.
neoformans and C. albicans with 2,0mM Mg2+,
300μM of each deoxynucleotide triphosphates
(dNTPs), 0,02μM of each primer and annealing
temperature 55oC and 57oC. In vitro, the nested
- multiplex PCR was tested on isolated DNA
of two yeasts. The results showed that both of
them provided 100% sensitivity and specificity.
The minimum PCR detection limit was 1
pg of purified DNA from the corresponding
C. neoformans and C. albicans. This assay
provides a rapid and reliable solution compared
to conventional methods to diagnose C.
neoformans and C. albicans
Từ khóa:
PCR lồng, PCR đa mồi, chẩn đoán, Cryptococcus neoformans, Candida albicans
Keywords:
nested PCR, multiplex PCR, diagnosis, Cryptococcus neoformans, Candida albicans
File nội dung:
o170275.pdf
Tải file:
